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defgf96tj · Wysłany: Wto 5:45, 08 Mar 2011 Temat postu: ugg boots España p27、p53蛋&

p27、p53蛋白在口腔鳞癌中的表达和意义
凋亡起到干预作用。本实验用6．羟基多巴胺作用于NGF诱导后PC12细胞，建立帕金森病细胞模型，用RNAi方法对Fas基因表达进行抑制，从而观察该方法以帕金森病细胞凋亡的影响。1材料和方法1．1细胞培养和诱导PC12细胞于完全培养液(RP1640+15％新生牛血清+青霉素)中培养，每3d换液1次，5—6d传代1次。取对数生长期PC12细胞,[link widoczny dla zalogowanych]，消化、离必后用完全培养基重悬，密度为lO5·mL-1待80％汇合时吸去1日的培养液，加入新培养液备用。成熟的PC12细胞接种于到含有50nIIll(约2nmol·L-1)NGF的完全DMEM培养液中，使细胞密度达到2．5—1O×lO4·cm一，每2—3天换液一次，约一周左右形成神经纤维，并且持续培养1O天，成为类神经细胞。1．2实验分组及传染将细胞分为完全培养液对照组、模型组、GFPsiRNA(绿色荧光蛋白基因干扰)RNA组；FassiRNA(Fas基因干把)RNA组。细胞转染：试剂由大连宝生物公司提供。将细胞接种于24孔培养板，48h后细胞融合达46—6o％进行传染。每组设1O个样本，转染24h，进行6．羟基多巴胺处理。1．3建立帕金森病细胞模型取NGF诱导后PC12细胞，消化、离心后用完全培养基重悬，密度lO5·mL～，待8o％汇合时吸去1日的培养液，加入新培养液备用。将模型组与GFPsiRNA组；FassiRNA组细胞接种于162cII组织培养板中，待细胞巾壁成单层后，去上清，加入6．羟基多巴胺培养24h后进行Fk、Caspase-3表达及细*通讯作者胞凋亡相关检测。1．4GsiRNA和Fas序列Fas5’P．AUACAUCCCGAGAAUUGCUdrdr．3’(sense)，5’．P．AGCAAL几JCUCGGGAUGUAUdTdT-3’(anti．sense)，GFP5’P．GGCUACGUCCAGGAGCGCACG-3’(F~tkqe)5’P．UGCGCUCCUGACGUAGCCUU-3(anfisense)．(试剂购自大连宝生物公司)1．5'IIJNEL法检测细胞凋亡脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法(-I1『NⅡ，)用细胞凋亡试剂盒(罗氏公司)。细胞用40g／L多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋、切片。步骤按细胞凋亡试剂盒说明书进行。结果判断：细胞核被染成棕黄色为阳性。每张切片在400倍高倍视野下随机取2o个视野，计数阳性细胞数。1．6流式细胞仪()分析3IIll培养液含5×105个细胞培养于6孔板，PBS液洗涤2遍，再用预冷的体积分数70％乙醇固定，4"12过夜，采用H(50ms／L)染色分析亚二倍体峰,[link widoczny dla zalogowanych]，分析细胞凋亡比例,[link widoczny dla zalogowanych]。重复实验1O次。1．7FCIVl检测Fas、Caspase-3表达取细胞悬液(约lxlo6个／m1)，低速离心除去固定液，PBS洗两次。抗Fas、Caspase-3抗体的标记采用间接荧光免疫法。将上述制备好的单细胞悬液用PBS洗两次,[link widoczny dla zalogowanych]，分别用加入1：200稀释的特异性抗体5O，37℃水浴30min，离心弃上清,[link widoczny dla zalogowanych]，加入1：200稀释的F~G4gG100，37"12水浴30rain，离心弃上清，PBS洗1次以去除未结合的荧光抗体。上机前加入1mlPBS，400目筛网过滤，上机分析。F鹊、Caspase-3蛋白表达量以平均荧光强度表示。1．8统计方法计量资料描述采用均数±标准差，用SPSS12．0对数据进行统计学处理。2结果2．11【1胍染色结果'RJNEL染色显示凋亡的细胞核内有分布均匀的深蓝色
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